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一株乳酸乳球菌產(chǎn)γ-氨基丁酸能力及其安全性評價

文檔作者：孟丹1 王麗群2 謝國梁1 劉曉艷1 于純淼1 國立東1 文檔來源： 1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院		點擊數(shù)：	更新時間： 2025年03月03日
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上一篇：影響醬腌菜質(zhì)量的因素及防腐應(yīng)注意的問題…

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China Brewing 2017 Vol.36 No．4
Serial No．302
乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌
的通稱[1]，其作為工業(yè)微生物應(yīng)用具有悠久的歷史，廣泛
用于酸奶、開菲爾、泡菜等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)。繼“酸奶
長壽說”提出之后，乳酸菌對人體健康的有益作用一直是
人們關(guān)注的焦點，目前公認(rèn)的益生功能主要包括：調(diào)節(jié)腸
道菌群平衡[2]、調(diào)節(jié)免疫[3]、降膽固醇[4]、降血壓[5]、降血糖[6]、
抗腫瘤[7-8]、抗過敏[9]等。然而，這些益生功能并不是所有乳
酸菌的共性，不同種屬的乳酸菌甚至是同一種屬的不同株
之間益生功能也不盡相同，但也有集兩種以上益生功能于
一身的乳酸菌菌株，如鼠李糖乳桿菌GG株（LGG）[10-11]。課題
組先前從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品—開菲爾發(fā)酵乳中分離到一株
乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株，益生特性良好[12]且體
內(nèi)外試驗均證實了其降膽固醇作用[13-14]。菌株HUCM 201
是否還具有其他益生功能仍不清楚，另外，盡管乳酸菌通
常被認(rèn)為是安全的，但仍有個別關(guān)于乳酸菌引起感染事件
的報道[15-17]。鑒于此，本試驗對乳酸乳球菌乳亞種菌株
HUCM 201產(chǎn)γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的
能力進(jìn)行了檢測，并對其安全性進(jìn)行了初步評價，包括硝
基還原酶活性、生物胺產(chǎn)生能力、吲哚生成以及溶血性試
驗，旨在為其作為益生菌應(yīng)用提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
1.1.1 菌種
乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis）
HUCM 201菌株：來源于開菲爾發(fā)酵乳，實驗室自行分離
鑒定并保存。大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922和金
黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923為黑龍
江中醫(yī)藥大學(xué)實驗室保存。
一株乳酸乳球菌產(chǎn)γ-氨基丁酸能力及其安全性評價
孟丹1，王麗群2，謝國梁1，劉曉艷1，于純淼1，國立東1*
（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，黑龍江哈爾濱150086）
摘要：探討了乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201產(chǎn)γ-氨基丁酸的能力，并初步評價了其安全性。以γ-氨基丁酸含量為評價指標(biāo)，通過正
交試驗優(yōu)化了乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株產(chǎn)γ-氨基丁酸的發(fā)酵條件，即接種量為4%、初始pH值6.5，發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時間
60 h，其發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度可達(dá)218.7 μg/mL。通過硝基還原酶活性檢測、生物胺產(chǎn)生能力分析、吲哚試驗和溶血性試
驗，初步評價了菌株HUCM 201的安全性，發(fā)現(xiàn)其硝基還原酶陰性，吲哚試驗陰性，無溶血，不能產(chǎn)生酪胺、組胺、尸胺和腐胺生物胺
類物質(zhì)，可初步認(rèn)為是一株安全的益生菌。
關(guān)鍵詞：乳酸菌；γ-氨基丁酸；生物胺；安全性
中圖分類號：TS201.3 文章編號：0254-5071（2017）04-0072-06 doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.016
γ-aminobutyric acid-producing ability and safety evaluation ofLactococcus lactis
MENG Dan1, WANG Liqun2, XIE Guoliang1, LIU Xiaoyan1, YU Chunmiao1, GUO Lidong1*
(1.College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;
2.Food Processing Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China)
Abstract：The γ-aminobutyric acid-producing ability of Lactococcus lactis subsp. lactis HUCM 201 was discussed and the strain safety was preliminarily
evaluated. Using γ-aminobutyric acid concentration as evaluation index, the optimal fermentation condition of strain HUCM 201 was evaluated
by orthogonal experiments. The optimal fermentation condition was inoculum 4%, initial pH 6.5, fermentation temperature 31 ℃ and time 60 h. The
γ-aminobutyric acid concentration was determined as 218.7 μg/ml based on the optimal fermentation condition. Moreover, the safety ofL. lactis subsp.
lactis HUCM 201 was evaluated via nitroreductase activity determination, biogenic amines production analysis, indole experiments and haemolysis
experiments. The results suggested that the strain HUCM 201 was a nitroreductase-negative, indole-negative, haemolysis-negative bacterium, and
could not produce biogenic amines, such as tyramine, histamine, cadaverine, and putrescine. Thus, L. lactis subsp. lactis HUCM 201 was preliminarily
considered as safe probiotic bacterium.
Key words：lactic acid bacteria; γ-aminobutyric acid; biogenic amine; safety
收稿日期：2016-07-04
基金項目：黑龍江省自然科學(xué)基金項目（C2016052）；黑龍江省教育廳面上項目（12531631）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?？蒲谢痦椖浚?01104）
作者簡介：孟丹（1978-），女，講師，碩士，研究方向為食品營養(yǎng)與衛(wèi)生。
*通訊作者：國立東（1982-），男，副教授，博士，研究方向為功能食品與食品生物技術(shù)。
·72· Research Report
中國釀造2017 年第36 卷第4 期
總第302 期
1.1.2 培養(yǎng)基
改良MRS（mMRS）培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[18]的方法配
制：蛋白胨5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，牛肉膏5.0 g，
葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.0 g，乙酸鈉5.0 g，七水硫酸鎂0.58 g，
四水硫酸錳0.25 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，
蒸餾水加至1 L，用HCl調(diào)至pH 6.2，121℃濕熱滅菌15 min。
LB培養(yǎng)（基用于培養(yǎng)大腸桿菌）：胰蛋白胨10.0 g，酵母
粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水加至1 L，調(diào)pH值至7.4，121 ℃
濕熱滅菌15 min。
胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養(yǎng)基（用
于培養(yǎng)金黃色葡萄球菌）：胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，
葡萄糖2.5 g，氯化鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.5 g，蒸餾水加至
1 L，調(diào)pH值至pH 7.2±0.2，121 ℃濕熱滅菌15 min。
胰蛋白胨酵母膏葡萄糖（tryptone yeast glucose，TYG）
液體培養(yǎng)基（用于發(fā)酵培養(yǎng)）參照文獻(xiàn)[19]配制：胰蛋白胨
5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，丁二酸鈉5.0 g，蒸餾水加
至1 L，HCl調(diào)至pH 6.8，121 ℃濕熱滅菌15 min。
硝基還原酶活性檢測培養(yǎng)基（用于檢測乳酸菌的硝基
還原酶活性）：蛋白胨10.0 g，硝酸鉀1.0 g，加蒸餾水至1 L，
pH值調(diào)至pH 7.4，121 ℃滅菌15 min。
氨基酸脫羧酶檢測培養(yǎng)基（用于檢測乳酸菌是否產(chǎn)生
生物胺）：胰蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，氯化鈉0.25 g，葡萄糖
0.5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳2.0 g，硫酸亞鐵0.04 g，檸檬酸銨
2 g，維生素B1 0.01g，磷酸氫二鉀2.0 g，碳酸鈣0.1 g，磷酸
吡哆醛0.05 g，吐溫-80 0.06 g，溴甲酚紫0.06 g，蒸餾水加至
1 L，調(diào)至pH 5.8～6.0，121 ℃濕熱滅菌15 min。
酪胺、組胺、尸胺或腐胺檢測培養(yǎng)基，是在上述培養(yǎng)基
中分別添加10.0 g的酪氨酸、組氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。
1.1.3 試劑
γ-氨基丁酸（GABA）標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；L-谷氨
酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基：
貝瑞特生物技術(shù)有限責(zé)任公司；三乙胺、正己烷、乙腈（均
為色譜純）：德國Merck公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，
HPLC）儀：安捷倫（中國）科技有限公司；AE200分析
天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DM2500顯微鏡：上
海徠卡顯微鏡有限公司；SPX-200-II生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)
醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公
司；BXM-30R全自動高壓滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；
PB-10 pH計：賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；TGL-20bR
離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠。
1.3 方法
1.3.1 菌株的培養(yǎng)
乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株，在37 ℃條件下培
養(yǎng)于mMRS培養(yǎng)基中。試驗前用mMRS液體培養(yǎng)基至少活
化3次。大腸桿菌培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中，金黃色葡萄球菌培
養(yǎng)在TSB培養(yǎng)基中，均采用37 ℃恒溫培養(yǎng)。
1.3.2 產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌發(fā)酵液的制備
將活化后的乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株按1%
接種量接種于含1%谷氨酸的TYG液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜
置培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液離心后取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過
濾后得無菌上清液，供HPLC檢測分析。
（1）單因素試驗條件優(yōu)化
分別考察不同發(fā)酵時間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）、
初始pH值（pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、發(fā)酵溫度（28℃、31℃、
34 ℃、37 ℃、40 ℃）以及接種量（1%、2%、3%、4%、5%）對乳
酸菌發(fā)酵液中GABA積累量的影響。
（2）正交試驗條件優(yōu)化
在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初
始pH值和接種量為影響因素，以GABA含量為評價指標(biāo)，
采用L9 （ 34）正交設(shè)計優(yōu)化，試驗因素與水平見表1。
1.3.3 乳酸菌發(fā)酵液γ-氨基丁酸的檢測
（1）高效液相色譜條件
色譜柱采用Syncronis-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；
流動相A為50 mmol/L醋酸鈉（pH 6.5）-5%乙腈溶液，流動
相B為80%乙腈溶液，流速1.0 mL/min，柱溫為35 ℃進(jìn)行梯
度洗脫，洗脫梯度程序見表2；檢測器為紫外檢測器，檢測
波長為254 nm，進(jìn)樣量10 μL。
（2）衍生化處理
取標(biāo)準(zhǔn)品溶液或供試無菌上清液200 μL，加入3 mol/L
表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for
fermentation conditions optimization
水平發(fā)酵時間/h 初始pH值發(fā)酵溫度/℃ 接種量/%
1
2
3
48
60
72
5.5
6.0
6.5
28
31
34
2
3
4
表2 分離γ-氨基丁酸梯度洗脫程序
Table 2 Gradient elution program for γ-aminobutyric acid separation
時間/min
0
2
15
25
30
32
40
100
100
85
10
10
100
100
0
0
15
90
90
0
0
流動相/%
A B
研究報告 ·73·
China Brewing 2017 Vol.36 No．4
Serial No．302
三乙胺乙腈溶液100 μL、0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液
100 μL，混勻，室溫放置1 h，加入400 μL正己烷充分混勻，
靜置10 min，取下層溶液，再次加入400 μL正己烷，充分
混勻，靜置10 min。吸取下層溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，
取20 μL樣品進(jìn)樣進(jìn)行色譜分析。
1.3.4 硝基還原酶活性檢測
供試菌株按1%接種量接種于硝基還原酶檢測培養(yǎng)基
中，37℃恒溫培養(yǎng)72 h，依次向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入α-萘胺溶
液和對氨基苯甲磺酸溶液，觀察培養(yǎng)基顏色的變化。大腸
桿菌ATCC 25922為陽性對照菌株。未接種細(xì)菌的硝基還
原酶檢測培養(yǎng)基為空白對照。
1.3.5 生物胺產(chǎn)生能力檢測
供試菌株接種于含0.1%氨基酸（酪氨酸、組氨酸、賴
氨酸或鳥氨酸）和0.005%的5′-磷酸吡哆醛的MRS液體培
養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，分別劃線于酪
胺、組胺、尸胺、腐胺檢測培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h后觀察菌
落周圍培養(yǎng)基顏色的變化。同空白培養(yǎng)基相比，若培養(yǎng)基呈
黃色則為陰性結(jié)果；若培養(yǎng)基呈紅色或紫色則為陽性結(jié)果。
1.3.6 吲哚試驗
供試菌株接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)
72 h，加入吲哚試劑8～10滴觀察顏色變化。若液面出現(xiàn)玫
瑰紅色則為陽性結(jié)果，否則為陰性結(jié)果。大腸桿菌ATCC
25922為陽性對照菌株。未接種細(xì)菌的蛋白胨水培養(yǎng)基為
空白對照。
1.3.7 溶血試驗
供試菌株劃線接種于含質(zhì)量濃度5 g/100 mL人體血
液的哥倫比亞瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍
變化情況。若菌落周圍形成透明圈則為β-溶血；若出現(xiàn)綠
色圈，則為α-溶血；若無溶血環(huán)，則為γ-溶血，也稱無溶血。
以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為陽性參照菌株。
2 結(jié)果與分析
2.1 菌株HUCM 201發(fā)酵液中GABA的定量分析
乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株培養(yǎng)于含1%谷氨
酸的TYG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后，采用柱前衍生化高效液
相色譜方法對發(fā)酵液中GABA含量進(jìn)行測定，GABA標(biāo)準(zhǔn)
品及菌株發(fā)酵液的高效液相色譜圖如圖1所示。
圖1 γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（A）以及發(fā)酵液（B）的高效液相色譜圖
Fig. 1 HPLC chromatogram of γ-aminobutyric acid standard (A) and fermentation broth (B)
圖2 發(fā)酵時間對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響
Fig. 2 Effect of fermentation time on γ-aminobutyric acid production
從圖1可知，發(fā)酵液中GABA與其他雜質(zhì)通過該方法可
有效分開，GABA的保留時間為16.0 min左右。通過外標(biāo)法
以峰面積定量可知，菌株HUCM 201在含1%谷氨酸的TYG
液體培養(yǎng)基中37 ℃發(fā)酵48 h后，發(fā)酵液中GABA的質(zhì)量濃
度可達(dá)95.3 μg/mL。
2.2 菌株HUCM 201產(chǎn)GABA條件優(yōu)化單因素試驗
2.2.1 發(fā)酵時間對GABA產(chǎn)量的影響
菌株HUCM 201按1%接種量接種于含1%谷氨酸的
TYG液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，于不同時間點取發(fā)
酵液，并經(jīng)處理后供HPLC檢測GABA含量，結(jié)果如圖2
所示。
由圖2可知，GABA含量隨發(fā)酵時間的增加呈上升趨勢，
菌株HUCM201發(fā)酵60 h后，發(fā)酵液中GABA累積量趨于平
穩(wěn)，60 h時GABA含量為134.8 μg/mL，72 h時為138.7 μg/mL，
二者差異不顯著。故最佳發(fā)酵時間為60 h。
2.2.2 初始pH值對GABA產(chǎn)量的影響
菌株HUCM 201按1%接種量接種于不同初始pH值的
含1%谷氨酸的TYG液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)60 h，發(fā)
酵液經(jīng)處理后供HPLC檢測GABA含量，結(jié)果如圖3所示。
·74· Research Report
中國釀造2017 年第36 卷第4 期
總第302 期
由圖3可知，GABA含量隨初始pH值的升高呈先上升
后下降的趨勢，在初始pH值為6.0時，發(fā)酵液中GABA累積
量最大，達(dá)到149.4 μg/mL，故最佳初始pH值為6.0。
2.2.3 發(fā)酵溫度對GABA產(chǎn)量的影響
菌株HUCM 201按1%接種量接種于含1%谷氨酸的
TYG液體培養(yǎng)基（pH 6.0）中，不同溫度下靜置培養(yǎng)60 h，發(fā)
酵液經(jīng)處理后供HPLC檢測GABA含量，結(jié)果如圖4所示。
由圖4可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，GABA含量首先隨之
升高，培養(yǎng)溫度為31℃時，菌株HUCM201發(fā)酵液中GABA
累積量最大，GABA含量達(dá)到191.2 μg/mL，發(fā)酵溫度超過
31℃后GABA產(chǎn)量出現(xiàn)明顯下降。故最佳發(fā)酵溫度為31℃。
2.2.4 接種量對GABA產(chǎn)量的影響
菌株HUCM 201按不同接種量接種于含1%谷氨酸的
TYG液體培養(yǎng)基（pH 6.0）中，31 ℃靜置培養(yǎng)60 h，發(fā)酵液經(jīng)
處理后供HPLC檢測GABA含量，結(jié)果如圖5所示。
由圖5可知，接種量為3%時，菌株HUCM 201發(fā)酵液中
GABA累積量最大，GABA含量達(dá)到213.4 μg/mL，接種量超
過3%后GABA產(chǎn)量無明顯變化。故最佳接種量為3%。
2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化正交試驗
根據(jù)單因素條件優(yōu)化結(jié)果，選擇發(fā)酵時間、初始pH值、
發(fā)酵溫度、接種量4個因素，以GABA產(chǎn)量為評價指標(biāo)，按
照L9 （ 34）正交表進(jìn)行正交試驗，優(yōu)化結(jié)果如表3所示。
由表3結(jié)果可知，對GABA產(chǎn)量影響大小依次為發(fā)酵溫
度＞發(fā)酵時間＞接種量＞初始pH值，最佳組合為A2B3C2D3，
以此為最佳發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，即菌株HUCM 201按4%接
種量接種于含1%谷氨酸的TYG液體培養(yǎng)基（pH 6.5）中，
31 ℃培養(yǎng)60 h，GABA的產(chǎn)量達(dá)到218.7 μg/mL。
2.4 硝基還原酶活性檢測結(jié)果
菌株的硝基還原酶活性檢測結(jié)果如圖6所示。由圖6
可知，接種大腸桿菌ATCC 25922的培養(yǎng)基顏色變成了紅
圖3 初始pH值對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響
Fig. 3 Effect of initial pH on γ-aminobutyric acid production
圖4 發(fā)酵溫度對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響
Fig. 4 Effect of fermentation temperature on γ-aminobutyric
acid production
圖5 接種量對γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響
Fig. 5 Effect of inoculum on γ-aminobutyric acid production
表3 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗優(yōu)化結(jié)果分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for
fermentation conditions optimization
試驗號A B C D GABA含量/（μg·mL-1）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
k1
k2
k3
極差R
1
1
1
2
2
2
3
3
3
138.3
172.3
163.0
34.0
1
2
3
1
2
3
1
2
3
140.3
166.2
167.1
25.9
1
2
3
2
3
1
3
1
2
137.4
183.3
153.0
45.9
1
2
3
3
1
2
2
3
1
143.9
156.3
173.5
29.6
86.3
170.5
158.2
195.8
161.7
159.5
138.9
166.4
183.6
圖6 硝基還原酶活性檢測結(jié)果
Fig. 6 Determination results of nitroreductase activity
研究報告 ·75·
China Brewing 2017 Vol.36 No．4
Serial No．302
色，為陽性結(jié)果；而接種HUCM 201菌株的培養(yǎng)基顏色并
未發(fā)生變化，其硝基還原酶活性試驗結(jié)果呈陰性，說明菌
株HUCM 201不能產(chǎn)生硝基還原酶，不會將環(huán)境中的硝酸
鹽還原為亞硝酸鹽進(jìn)而產(chǎn)生有害代謝物。
2.5 生物胺產(chǎn)生能力檢測結(jié)果
生物胺產(chǎn)生能力的檢測結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，菌株
HUCM201連續(xù)轉(zhuǎn)接于含0.005%的5′-磷酸吡哆醛和0.1%
酪氨酸、組氨酸、賴氨酸或鳥氨酸其中一種氨基酸的MRS
液體培養(yǎng)基10代后，分別劃線接種于酪胺、組胺、尸胺或腐胺
檢測培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，4種培養(yǎng)基均呈現(xiàn)為黃色，說明該
菌株在生長過程中并未產(chǎn)生堿性物質(zhì)而使培養(yǎng)基呈現(xiàn)紫色
或紅色，均為陰性結(jié)果。由此說明，菌株HUCM201在生長過
程中并不會產(chǎn)生酪胺、組胺、尸胺或腐胺的有害代謝產(chǎn)物。
2.6 吲哚試驗結(jié)果
供試菌株于37℃培養(yǎng)于蛋白胨水培養(yǎng)基中72 h后，加入
吲哚試劑檢測吲哚產(chǎn)生情況，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，
加入吲哚試劑后，大腸桿菌ATCC 25922發(fā)酵液的液面出現(xiàn)
玫瑰紅色，呈陽性結(jié)果；而菌株HUCM 201發(fā)酵液的液面
顏色未發(fā)生變化，為陰性結(jié)果。由此說明，菌株HUCM201在
生長過程中不會代謝產(chǎn)生色氨酸酶分解蛋白胨中的色氨
酸生成吲哚。
2.7 溶血試驗結(jié)果
溶血試驗結(jié)果如圖9所示，供試菌株于哥倫比亞血瓊
脂平板上37℃培養(yǎng)48 h后，金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌
落周圍出現(xiàn)了透明圈，發(fā)生了β-溶血，而菌株HUCM 201
菌落周圍無溶血環(huán)出現(xiàn)，為γ-溶血，即不溶血。由此說明，
菌株HUCM 201無溶血能力，不會引起人體出現(xiàn)溶血。
由上述硝基還原酶試驗、生物胺產(chǎn)生能力檢測、吲哚
試驗以及溶血試驗的結(jié)果可知，菌株HUCM 201為硝基還
原酶陰性、吲哚試驗陰性、無溶血、不能產(chǎn)生酪胺、組胺、尸
胺以及腐胺生物胺類有害代謝物，可初步判定其為一株安
全的益生菌。
3 結(jié)論
乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201菌株在其生長代謝過
程中能產(chǎn)生重要的活性物質(zhì)—γ-氨基丁酸，在單因素試驗
基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化了其產(chǎn)GABA的發(fā)酵條件，菌株
HUCM 201按4%接種量接種于含1%谷氨酸的TYG培養(yǎng)基
（pH 6.5）中31 ℃發(fā)酵60 h，其發(fā)酵液中GABA的質(zhì)量濃度
可達(dá)218.7 μg/mL，并且該菌株不能代謝產(chǎn)生硝基還原酶，
不能產(chǎn)生酪胺、組胺、尸胺或腐胺生物胺類有害代謝物，也
不能利用色氨酸產(chǎn)生吲哚有害代謝物，不會引起人體血液
發(fā)生溶血，可初步認(rèn)為是一株較為安全的益生菌，但菌株
HUCM 201作為益生菌應(yīng)用前仍需做更為全面系統(tǒng)的安
全性評價。
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圖7 菌株HUCM 201產(chǎn)生物胺的檢測結(jié)果
Fig. 7 Determination results of biogenic amines production by
strain HUCM 201
圖8 吲哚試驗結(jié)果
Fig. 8 Results of indole experiments
圖9 溶血試驗結(jié)果
Fig. 9 Results of haemolysis experiments
·76· Research Report
中國釀造2017 年第36 卷第4 期
總第302 期
bacillus salivarius UBL S22 and prebiotic fructo-oligosaccharide on serum
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