導(dǎo)讀：畜禽養(yǎng)殖場作為抗生素抗性基因的一個熱點區(qū)，其產(chǎn)生的廢水中存在大量的抗生素抗性基因，直接排放將會污染接受的水體.本研究以微生物固化曝氣技術(shù)為核心，構(gòu)建了一個包含沉淀池、一級處理池、二級處理池和氧化塘的養(yǎng)殖廢水處理系統(tǒng).采用高通量熒光定量PCR 技術(shù)，探究各種抗性基因在進(jìn)水、各處理池和出水中的種類、多樣性和豐度的變化以及可能的影響因素.研究發(fā)現(xiàn)： （ 1） 微生物固化曝氣技術(shù)能有效降低養(yǎng)殖廢水中抗性基因的種類和多樣性； （ 2） 該技術(shù)也能有效去除養(yǎng)殖廢水中抗性基因的絕對豐度，去除率高達(dá)93.6%； （ 3） 養(yǎng)殖廢水出水中抗性基因絕對豐度仍高于自然水體，其直接排放仍有抗性基因污染風(fēng)險； （ 4）畜禽養(yǎng)殖廢水中TN 和土霉素的含量與許多抗生素抗性基因總豐度存在正相關(guān)性.通過對TN 和土霉素的去除或者控制使用，可以有效降低養(yǎng)殖廢水中的抗性基因。

抗生素在預(yù)防、治療微生物引起的疾病時具有良好的療效，同時還能促進(jìn)畜禽生長，所以被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖場[1-2].然而大多數(shù)抗生素并不能被動物腸道完全吸收，大部分仍以母體或者相關(guān)代謝產(chǎn)物的形式排出體外[2-3].這些排出體外的抗生素會對環(huán)境中的微生物產(chǎn)生一個選擇壓力，誘導(dǎo)和選擇環(huán)境微生物產(chǎn)生耐藥性，增加環(huán)境中抗性基因的豐度和多樣性[4].此外，喂食了抗生素的動物，其腸道內(nèi)抗性基因的豐度和多樣性均有所提高[5].動物腸道內(nèi)的耐藥菌和抗性基因隨著動物的排泄進(jìn)入環(huán)境中，直接增加了環(huán)境中抗性基因的豐度及多樣性。

抗生素抗性基因是一種新型的環(huán)境污染物[3，6].攜帶抗生素抗性基因的微生物（ 如致病菌等） 能對相應(yīng)的抗生素產(chǎn)生耐藥性，這使得抗生素在治療由致病菌引起的疾病時療效下降甚至無效，嚴(yán)重威脅人類健康[4，7].2011 年德國爆發(fā)“毒黃瓜”事件，在歐洲至少9 個國家蔓延，造成33 人死亡，超過3000 人受到感染，其中至少470 人出現(xiàn)腎功能衰竭并發(fā)癥，引起本次疫情的就是一種新型的高傳染性攜帶多種抗性基因的致病菌[4].在美國每年有超過200 萬人感染耐藥病原體，其中有14000 人死亡[6]。

固化微生物污水凈化器（ biocleaner） 是Bio Cleaner 公司研發(fā)的由微生物發(fā)生器與高效曝氣裝置組合的污水治理專用設(shè)備.對該裝置處理養(yǎng)殖廢水的研究結(jié)果表明： （ 1） 微生物固化曝氣技術(shù)能有效去除常規(guī)污染物，除TP 外，COD 和NH+4 -N 的出水濃度均能達(dá)到《畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（ GB 18596—2001） ； （ 2） 該技術(shù)對抗生素的去除效果依抗生素的種類而變，對4 種四環(huán)素類抗生素的去除率高達(dá)85%以上； 對大環(huán)內(nèi)酯類中的阿奇霉素的去除率為62.8%； 對大環(huán)內(nèi)酯類中的羅紅霉素和氟喹諾酮類抗生素則基本無效[8]。

本研究在之前研究[8]的基礎(chǔ)上，采用高通量熒光定量PCR 技術(shù)，進(jìn)一步研究： （ 1） 養(yǎng)殖廢水中各種抗生素抗性基因在進(jìn)水、各處理池、出水中的分布與變化； （ 2） 固化曝氣技術(shù)對各種抗生素抗性基因的去除效果； （ 3） 各種抗性基因的去除效果與常規(guī)污染物和抗生素的去除是否有耦合關(guān)系。

1 材料與方法（ Materials and Methods）

1.1 系統(tǒng)運行

處理系統(tǒng)采用美國Biocleaner 技術(shù)，由沉淀池、一級處理池、二級處理池和氧化塘組成.各處理單元的尺寸（ 長×寬×高） 分別為： 沉淀池25 m×20 m×5 m、一級處理池25 m×20 m×2 m、二級處理池25 m×20 m×2 m 和氧化塘40 m×30 m×4 m[8].各處理單元用管道連接，按照高程由高到低，依次排列沉淀池、一級處理池、二級處理池和氧化塘，省去不同處理單元間依靠泵為動力進(jìn)行的水力流動.該處理系統(tǒng)廢水來自于附近多個養(yǎng)殖場直排的清糞水，每日污水處理量為150—200 t.在一級處理和二級處理池中分別放置一個曝氣機(jī)和一個Biocleaner 設(shè)備，曝氣機(jī)功率為2.2 kV，采用人工開啟電閘控制，運行時間為24 h·d-1 .Biocleaner 設(shè)備裝載微生物載體，無需人工維護(hù).系統(tǒng)自2013 年8 月試運行，經(jīng)過12 個月調(diào)試，于2014 年8 月穩(wěn)定運行.本研究以穩(wěn)定運行監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2 樣點布設(shè)與采樣點概況

研究樣地位于龍巖市某養(yǎng)殖廢水處理示范點.依據(jù)處理系統(tǒng)的運行情況，于2014 年8 月，進(jìn)行1 次系統(tǒng)地采樣，采集12 個點，其中進(jìn)水1 個（ Ⅰ） ，沉淀池2 個（ Ⅱ） ，一級處理池（ Ⅲ） 、二級處理池（ Ⅳ） 和氧化塘（ Ⅴ） 各3 個（ 圖1） .分析測試了12 個點的NH+4 -N、NO-3 -N、TN、TP、COD、TOC、9 種抗生素（ 4 種四環(huán)素： 土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素； 2 種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素： 羅紅霉素、阿奇霉素； 3 種氟喹諾酮類抗生素： 氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星） ，研究結(jié)果已經(jīng)發(fā)表[8].本研究選取進(jìn)水以及各處理單元出水樣品（ Ⅰ-1、Ⅱ-2，Ⅲ-2、Ⅳ-3、Ⅴ-3） 進(jìn)行抗生素抗性基因分析。

1.3 DNA 提取

根據(jù)水樣的渾濁程度，量取一定體積的水樣倒入50 mL 離心管中，12000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，倒掉上清液，在每個離心管中加入1 mL 生理鹽水，將底部的沉淀充分混勻.再將樣品全部轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，18000 r·min-1離心5 min 后，倒掉上清液.若所得固體沉淀樣品過少，則重復(fù)上述操作，直到所得樣品約為0. 5 g.然后加入978 μL PBS 緩沖液（ FastDNA  SPIN kit for Soil 試劑盒，MPBiomedical，美國） ，并全部轉(zhuǎn)移到試劑盒中的Lysing Matrix E 管，按試劑盒提供的操作說明進(jìn)行提取.具體步驟如下： 加入122 μL MT Buffer，在FastPrep  儀器中進(jìn)行振蕩破碎均質(zhì)化（ 時間30 s，速度6.0 m·s-1 ） ，然后對Lysing Matrix E 管進(jìn)行離心處理（ 14000 r·min-1，15 min） .將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的2 mL離心管中，加入250 μL PPS，并用手搖10 次進(jìn)行混合.對樣品再一次進(jìn)行離心（ 14000 r·min-1，5 min） ，將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的2 mL 離心管中，并加入1 mL Binding Matrix Suspension，用手上下顛倒2 min，使DNA 附著到基質(zhì)上，靜置約3 min.去除約500 μL 上清，分多次將Binding Matrix 全部轉(zhuǎn)移到SPINTM Filter 中，加入500 μL SEWS-M 到SPINTM Filter 中對Binding Matrix 進(jìn)行清洗，通過離心去除SEWS-M，在室溫下風(fēng)干SPINTM Filter 5 min.最后加入70 μL DES 溶液進(jìn)行DNA 洗脫。

1.4 高通量熒光定量PCR

本實驗采用SmartChip Real-time PCR Systems（ WaferGen 公司，美國） 的高通量熒光定量的反應(yīng)平臺[9-11].總共使用了296 對引物，由于一個基因有多個引物，因此共有214 對抗性基因的引物（ 基本上覆蓋目前所有的抗性基因種類） ，5 對可移動原件基因引物和1 對16S rRNA 基因引物.

反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與Ouyang 等[11]和黃福義等[12]的一致.采用100 nL 反應(yīng)體系，各試劑濃度為：LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master Mix 1×，DNA 濃度5 ng·μL-1，BSA 濃度1 ng·μL-1和1 μmol·L-1引物.反應(yīng)程序為： 95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個循環(huán)； 程序自動升溫進(jìn)行溶解曲線分析.

定量PCR 數(shù)據(jù)處理參照文獻(xiàn)進(jìn)行[11，13]，以CT值31 作為儀器的檢測閾值.每個樣品進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)，只有當(dāng)每個樣品中3 個重復(fù)同時檢測出時，才認(rèn)為目的基因被有效檢出.抗性基因相對拷貝數(shù)的計算參照公式（ 1） 和（ 2） [5，11，13]，然后通過16S rRNA 絕對拷貝數(shù)與抗性基因相對拷貝數(shù)計算出抗性基因的絕對拷貝數(shù)（ 公式3） .

基因拷貝數(shù)= 10（ （ 31-CT） /（ 10/3） ） （ 1）

抗性基因相對拷貝數(shù)（ 相對豐度） = 抗性基因拷貝數(shù)/16S rRNA 基因拷貝數(shù)（ 2）

抗性基因絕對豐度=抗性基因相對拷貝數(shù)×16S rRNA 基因的絕對拷貝數(shù)（ 3）

1.5 16S rRNA 定量

采用Roche 480 定量PCR 儀測定樣品中的16S rRNA 基因，并采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒外標(biāo)法對其豐度進(jìn)行絕對定量[11].標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒原始濃度為1.39×109 copies·μL-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線（ 10 倍稀釋） 的范圍為1.39×103—1.39×109 copies·μL-1 .使用20 μL 反應(yīng)體系： 10 μL 2×LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master Mix，上下游引物各1 μL，1 μL DNA 模板和7 μL 無菌水.反應(yīng)運行程序為： 95 ℃預(yù)變性5 min，40 個循環(huán)（ 95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸15 s） ，儀器自動添加溶解曲線程序.用滅菌超純水代替樣品進(jìn)行陰性對照，每個樣品均做3 次重復(fù).

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

平均值以及標(biāo)準(zhǔn)差使用Excel 2007 版本進(jìn)行計算； 顯著性分析和Pearson 相關(guān)分析使用SPSS 17.0版本進(jìn)行分析； 在計算檢測到的基因數(shù)量時，由于一個基因有多個引物，如果有多對引物檢測出同一個基因，在計算時只算檢出一個.

2 結(jié)果與討論（ Results and Discussion）

2.1 抗性基因多樣性

在整個處理系統(tǒng)中，所有水樣中共檢出123 種抗性基因和5 種可移動遺傳元件.進(jìn)水中檢測出111 種抗性基因和可移動遺傳元件（ MGES） ，沉淀池、一級處理池中均檢測出115 種，二級處理池和出水中分別檢測出108 種和95 種，比進(jìn)水（ 111 種） 略有降低（ 圖2） .此外，二級處理池和出水的Shannon 和Inverse Simpson 指數(shù)也均低于進(jìn)水（ 表1） .這說明微生物固化曝氣技術(shù)能降低養(yǎng)殖廢水中抗性基因的多樣性.該出水是直接排入九龍江流域的.在九龍江流域城市河段的2 個水樣中，檢測出的抗性基因數(shù)量分別為131 和161 種[11].本研究中畜禽養(yǎng)殖廢水出水中所檢測到的抗性基因種類較少，為90 個.這說明九龍江流域中抗性基因的來源不僅有畜禽養(yǎng)殖廢水這一種途徑，應(yīng)該還有來自于城市污水處理廠這一途徑。

根據(jù)抗性基因?qū)股氐目剐詸C(jī)制，可將檢測到的抗性基因分為抗生素失活（ antibiotic deactivate） 、抗生素外排（ efflux pump） 、細(xì)胞核糖體保護(hù)（ cellular protection） 和其他（ unknown） 4 種類型.抗生素失活機(jī)制的抗性基因，在各種樣品中占46.67% — 50.91%（ 表2） .黃福義等[12]研究長期施用豬糞的水稻土以及Ouyang 等[11]研究九龍江流域的水體時，也發(fā)現(xiàn)抗生素失活機(jī)制的抗性基因所占比例最大，分別為：42.59%和49.06%.這說明攜帶抗生素失活機(jī)制基因的微生物是各種環(huán)境介質(zhì)中常見的種類.抗生素外排機(jī)制的抗性基因，其檢出種類僅次于抗生素失活機(jī)制的抗性基因，從進(jìn)水的30.19%到出水的32.22%.攜帶抗生素外排抗性基因的細(xì)菌，不僅可以將抗生素排出細(xì)胞外，還能將重金屬和其它有毒分子等排出體外[14].這使得攜帶抗生素外排泵抗性基因的微生物能更好地適應(yīng)環(huán)境.

從抗性基因所對應(yīng)的抗生素類型來看，所檢測出的抗性基因覆蓋了所劃分的9 種類型： 氨基糖苷類抗性基因（ aminoglycoside） 、β-內(nèi)酰胺類抗性基因（ beta-lactamase） 、氯霉素類抗性基因（ chloramphenicol） 、大環(huán)內(nèi)酯類林肯酰胺類鏈陽性菌素B 抗性基因（ MLSB） 、多重耐藥基因（ multidrug） 、磺胺類抗性基因（ sulfonae） 、四環(huán)素類抗性基因（ tetracycline） 、萬古霉素抗性基因（ vancomycin） 以及其它類型抗性基因（ others） .隨著污水處理的不斷深入，9 種類型的抗性基因數(shù)量在各個處理池間無明顯差異，在各處理池間所占比例分別為： 17.78%—19.42%、14.15%—17.78%、1.82%—2.22%、12.22%—17.92%、19.81%—21.11%、1.82%—2.22%、12.26%—14.44%、3.64%—5.66%和7.27%—8.18%（ 表2） .相對而言，多重耐藥基因檢出種類在各處理單元中所占比例最大.多重耐藥基因會使攜帶其的微生物對多種抗生素具有耐藥性，進(jìn)而有可能使微生物成為“超級細(xì)菌”.本研究說明該畜禽養(yǎng)殖廢水對人類健康有“超級細(xì)菌”的潛在威脅。

2.2 抗性基因豐度

經(jīng)微生物固化曝氣技術(shù)處理后，養(yǎng)殖廢水中抗性基因絕對豐度顯著減少（ 圖3） .進(jìn)水中抗性基因的絕對豐度為3.8×1010 copies·mL-1，而出水中為2.4×109 copies·mL-1，去除率達(dá)93.6%.沉淀池、一級處理池、二級處理池和氧化塘對抗性基因的去除貢獻(xiàn)不一樣： 沉淀池中抗性基因絕對豐度為3. 1 ×1010 copies·mL-1，去除率為18.0%； 一級處理池中抗性基因絕對豐度為6.6×109 copies·mL-1，去除率為64.7%； 二級處理池中抗性基因絕對豐度為3.2×109 copies·mL-1，去除率為9.0%； 氧化塘中抗性基因絕對豐度為2.4×109 copies·mL-1，去除率為1.9%.一級處理池對抗性基因去除貢獻(xiàn)最大，為64.7%.

抗性基因的相對豐度在各處理池間并沒有顯著區(qū)別（ 圖4） ，進(jìn)水為2.37，出水為3.14.這意味著抗性基因絕對豐度的減少是由于廢水中16S rRNA 絕對豐度（ 或者說微生物數(shù)量） 減少所引起的，而不是該處理系統(tǒng)能選擇性去除抗生素抗性基因.此外，相對于進(jìn)水，出水中抗性基因絕對豐度雖然減少了很多，但仍比自然水體高出不少.Ouyang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)九龍江流經(jīng)城市的河段水體中抗性基因的絕對豐度為9.7×107—1.0×108 copies·mL-1，發(fā)源地河段水體中抗性基因的絕對豐度為7.2×105 copies·mL-1 .這表明經(jīng)微生物固化曝氣技術(shù)處理后，養(yǎng)殖廢水中抗生素抗性基因仍有可能對排放的水體產(chǎn)生污染.

隨著養(yǎng)殖廢水的不斷處理，不同抗性機(jī)制抗性基因的絕對豐度比例也在發(fā)生變化（ 表3） .攜帶抗生素失活的抗性基因在各處理池之間無顯著變化，進(jìn)水中為43.2%，出水中為40.4%； 攜帶細(xì)胞核糖體保護(hù)的抗性基因在逐步降低，在進(jìn)水、沉淀池、一級處理池、二級處理池和出水中依次為23.5%、15.6%、6.2%、2.4%和5.3%； 攜帶外排泵機(jī)制的抗性基因在逐步增加，在進(jìn)水、沉淀池、一級處理池、二級處理池和出水中依次為33.3%、35.6%、48.5%、58.4%和54.2%.這進(jìn)一步說明，攜帶外排泵機(jī)制的抗性基因的微生物相對于攜帶其它抗性機(jī)制的基因的微生物來說，具有更好的環(huán)境適應(yīng)性.

從抗性基因所對應(yīng)的抗生素類型來看（ 表3） ： （ 1） 氨基糖苷類抗性基因和四環(huán)素類抗性基因在各處理單元中均穩(wěn)定地占有較高的比例（ 分別為30.4%—40.3%和25.1%—29.9%） ； （ 2） 多重耐藥基因雖然檢出種類最多，但是它們的絕對豐度在進(jìn)水中并不是最多的.然而，隨著養(yǎng)殖廢水的不斷處理，其所占比例逐步增加，在進(jìn)水、沉淀池和一級處理池中依次為： 19.2%、22.5%和26.5%，并在二級處理池（ 34.0%）和出水（ 32.8%） 中超過氨基糖苷類成為污水中豐度最高的抗性基因； （ 3） 雖然大環(huán)內(nèi)酯類林肯酰胺類鏈陽性菌素B 抗性基因及β-內(nèi)酰胺類抗性基因在各處理池中檢出的數(shù)量不少（ 表1） ，但是絕對豐度所占的比例卻很少（ 表3） ； （ 4） 在整個處理系統(tǒng)中，萬古霉素抗性基因絕對豐度所占的比例最小，在0.01%—0.02%之間，這應(yīng)該是由于萬古霉素抗生素僅用于人類疾病治療[11]，而生豬養(yǎng)殖行業(yè)不使用萬古霉素.

2.3 抗性基因與常規(guī)污染物、抗生素相關(guān)性分析

Forsberg 等[15]研究發(fā)現(xiàn)微生物群落組成是土壤抗性基因含量的主要決定因素； Su 等[9]同樣發(fā)現(xiàn)抗性基因與微生物群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān).氮、磷等常規(guī)污染物，作為微生物生長繁殖的必要營養(yǎng)物質(zhì)，可以通過影響微生物的生長，進(jìn)而影響抗性基因的豐度.將常規(guī)污染物濃度[8]與不同抗性機(jī)制抗性基因和不同抗生素種類抗性基因的絕對豐度進(jìn)行相關(guān)性分析（ 表4） 發(fā)現(xiàn)，TN 與外排泵機(jī)制抗性基因、磺胺類抗性基因、四環(huán)素類抗性基因和總抗性基因的絕對豐度呈顯著正相關(guān)（ P<0.05） ，這說明攜帶這幾類抗性基因的微生物的生長和繁殖受環(huán)境中總氮水平的制約.

抗生素濫用被認(rèn)為是導(dǎo)致環(huán)境中抗生素抗性基因急劇增加的主要因素.Looft 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，抗生素的使用能提高豬腸道內(nèi)抗生素抗性基因的豐度及多樣性； 梁惜梅等[16]也發(fā)現(xiàn)，珠江口水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)沉積物中抗生素總濃度與ARGs 總含量顯著相關(guān)； Wu 等[17]研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類抗生素殘余與四環(huán)素類抗性基因絕對豐度之間存在顯著相關(guān).研究發(fā)現(xiàn)土霉素濃度與多種抗性基因（ 氯霉素類抗性基因、大環(huán)內(nèi)酯類林肯酰胺類鏈陽性菌素B 抗性基因、四環(huán)素類抗性基因、細(xì)胞核糖體保護(hù)機(jī)制抗性基因、抗生素外排泵機(jī)制抗性基因和總抗性基因） 的絕對豐度均存在顯著正相關(guān)（ 表4） ； 四環(huán)素濃度除與β-內(nèi)酰胺類抗性基因的絕對豐度存在相關(guān)性外，與其它抗性基因間并無顯著相關(guān).這表明抗生素對抗性基因的影響因抗生素種類而異.養(yǎng)殖廢水中土霉素殘留可能是影響?zhàn)B殖廢水中抗性基因絕對豐度的重要原因，因此可以通過控制土霉素在養(yǎng)殖場中的使用，有效降低養(yǎng)殖廢水中抗性基因的絕對豐度.

3 結(jié)論（ Conclusion）

（ 1） 微生物固化曝氣技術(shù)能有效降低養(yǎng)殖廢水中抗性基因的種類和多樣性.

（ 2） 該技術(shù)也能有效去除養(yǎng)殖廢水中的抗生素抗性基因，去除率高達(dá)93.6%.沉淀池、一級處理池、二級處理池和氧化塘對抗性基因的去除貢獻(xiàn)分別為18.0%、64.7%、9.0%和1.9%.其中，一級處理池對抗性基因去除貢獻(xiàn)最大.

（ 3） 養(yǎng)殖廢水出水中抗性基因絕對豐度仍高于自然水體，其直接排放仍有抗性基因污染風(fēng)險.

（ 4） 畜禽養(yǎng)殖廢水中TN 和土霉素的含量與許多抗生素抗性基因總豐度存在正相關(guān)性.通過對這兩種物質(zhì)的去除或者控制使用，可能是降低養(yǎng)殖廢水中抗性基因豐度的一種有效途徑.